流式細(xì)胞術(shù)Flowcytometry
原理：流式細(xì)胞術(shù)(flowcytometry FCM)是對單個細(xì)胞或其他生物微粒進(jìn)行快速定量分析和分選的一門技術(shù)。在分析或分選過程中，包繞在流動液體中處理過的單個細(xì)胞或微粒通過聚焦的光源，產(chǎn)生電信號，這些信號代表光散射、熒光等參數(shù)，以此測定出細(xì)胞或微粒的物理和化學(xué)性質(zhì)，并可根據(jù)這些性質(zhì)分選出高純度的細(xì)胞亞群，以對其進(jìn)一步的培養(yǎng)或分析。
應(yīng)用：流式細(xì)胞術(shù)的功能決定了其在免疫學(xué)基礎(chǔ)研究中的廣泛應(yīng)用，目前在臨床上主要用于細(xì)胞表型分析、造血系腫瘤診斷和分型、移植前配型及與免疫有關(guān)疾病分析等。
（1）FCM在臨床醫(yī)學(xué)中應(yīng)用
淋巴細(xì)胞亞群分析、血小板分析、網(wǎng)織紅細(xì)胞分析、白血病和淋巴瘤免疫分型、HLA-B27表型分析、PNH診斷、人類同種異體器官移植中的應(yīng)用、艾滋病的診斷與治療。
（2）FCM在基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用
淋巴細(xì)胞功能、樹突狀細(xì)胞研究、造血干／祖細(xì)胞研究、細(xì)胞周期分析、細(xì)胞凋亡分析、總蛋白測定、細(xì)胞因子測定、細(xì)胞膜電位測定、胞內(nèi)鈣離子測定、細(xì)胞內(nèi)pH測定、細(xì)胞內(nèi)活性氧檢測、蛋白質(zhì)磷酸化檢測、flow-FISH法測定端粒長度。
作為應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測的技術(shù)平臺，現(xiàn)代流式細(xì)胞儀產(chǎn)生于上世紀(jì)六七十年代。經(jīng)過近四十年的發(fā)展和完善，今天的流式細(xì)胞儀已經(jīng)十分成熟，并被廣泛的運用于從基礎(chǔ)研究到臨床實踐的各個方面，涵蓋了細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、血液學(xué)、腫瘤學(xué)、藥理學(xué)、遺傳學(xué)及臨床檢驗等領(lǐng)域，在各學(xué)科中發(fā)揮著重要的作用。
一、流式細(xì)胞抗原染色方法
細(xì)胞表面抗原標(biāo)記：細(xì)胞在各自正常分化成熟的不同階段以及活化過程中，其細(xì)胞膜表面均可表達(dá)供鑒別的特殊結(jié)構(gòu)，即表面標(biāo)志。流式細(xì)胞術(shù)在細(xì)胞表面分子的檢測與分析主要應(yīng)用于免疫細(xì)胞及其亞群的檢測與功能分析；血液系統(tǒng)細(xì)胞表面標(biāo)志的研究；細(xì)胞群體及細(xì)胞表面標(biāo)志變化的檢測；細(xì)胞表面標(biāo)志構(gòu)成性質(zhì)分析。
細(xì)胞內(nèi)抗原標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞核內(nèi)染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)分析確定某些細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子或蛋白表達(dá)水平。分析細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞核內(nèi)抗原的關(guān)鍵在于熒光標(biāo)記的單克隆抗體能自由進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞核內(nèi)，且不能破壞細(xì)胞形態(tài)的完整性和保持細(xì)胞內(nèi)靶抗原不變。因此細(xì)胞內(nèi)或核內(nèi)染色的關(guān)鍵在于細(xì)胞固定和胞膜或核膜穿透。
A、表面抗原直接標(biāo)記
1、將消化下來的細(xì)胞用1 X PBS洗兩遍，然后用0.5 mL 0.5%BSA的 1 X PBS重懸。
2、加入等量預(yù)熱的4%多聚甲醛固定細(xì)胞，37℃，10分鐘。（可選步驟）
3、用0.5%BSA的1 X PBS洗兩遍。
4、3%BSA封閉。
5、樣本標(biāo)記：100μl 0.5%BSA的 1 X PBS內(nèi)細(xì)胞量為0.5-1X106個
a)不標(biāo)記細(xì)胞樣本
b)同型對照
c)標(biāo)記一抗
6、以抗體說明書上的比例加入抗體，冰上孵育30分鐘。
7、用0.5%BSA的 1 X PBS洗兩遍。
8、加入500 μl 1 X PBS上機(jī)檢測。
B、表面抗原間接標(biāo)記
1、將消化下來的細(xì)胞用1 X PBS洗兩遍，然后用0.5 mL 0.5%BSA的 1 X PBS重懸。
2、加入等量預(yù)熱的4%多聚甲醛固定細(xì)胞，37℃，10分鐘。（可選步驟）
3、用0.5%BSA的 1 X PBS洗兩遍。
4、樣本標(biāo)記：100μl 0.5%BSA的 1 X PBS內(nèi)細(xì)胞量為0.5-1X106個。
a)不標(biāo)記細(xì)胞樣本
b)單獨二抗
c)同型對照+二抗
d)一抗+二抗
5、以抗體說明書上的比例加入抗體，冰上孵育30分鐘。
6、用0.5%BSA的 1 X PBS洗兩遍。
7、0.5%BSA的 1 X PBS重懸細(xì)胞后加入等體積10%山羊血清，室溫孵育15分鐘。
8、加入熒光標(biāo)記二抗，放置冰上，避光條件下孵育30分鐘。
9、用0.5%BSA的1 X PBS洗兩遍。
10、加入500μl 1 X PBS上機(jī)檢測。
C、胞內(nèi)抗體直接標(biāo)記
1、將消化下來的細(xì)胞用1 X PBS洗兩遍，然后用0.5 mL 0.5%BSA的 1 X PBS重懸。
2、加入等量37℃預(yù)熱的4%多聚甲醛固定細(xì)胞，37℃孵育10分鐘。
3、用0.5%BSA的 1 X PBS洗兩遍并用1ml 90%的冰甲醇重懸細(xì)胞，放置冰上30分鐘。
4、用0.5%BSA的 1 X PBS洗兩遍。
5、3%BSA封閉。
6、樣本標(biāo)記：100μl 0.5%BSA的 1 X PBS內(nèi)細(xì)胞量為0.5-1X106個。
a)不標(biāo)記細(xì)胞樣本
b)同型對照
c)一抗
7、以抗體說明書上的比例加入抗體，冰上孵育30分鐘。
8、用0.5%BSA的 1 X PBS洗兩遍。
9、加入500μl 1 X PBS上機(jī)檢測。
D、胞內(nèi)抗體間接標(biāo)記
1、將消化下來的細(xì)胞用1 X PBS洗兩遍，然后用0.5 mL 0.5%BSA的 1 X PBS重懸。
2、加入等量預(yù)熱的4%多聚甲醛固定細(xì)胞，37℃孵育10分鐘。
3、用0.5%BSA的 1 X PBS洗兩遍并用1ml 90%的冰甲醇重懸細(xì)胞，放置冰上30分鐘。
4、用0.5%BSA的 1 X PBS洗兩遍。
5、樣本標(biāo)記：100μl 0.5%BSA的 1 X PBS內(nèi)細(xì)胞量為5X105-1X106個。
a)不標(biāo)記細(xì)胞樣本
b)單獨二抗
c)同型對照+二抗
d)一抗+二抗
6、以抗體說明書上的比例加入抗體，冰上孵育30分鐘。
7、用0.5%BSA的 1 X PBS洗兩遍。
8、0.5%BSA的 1 X PBS重懸細(xì)胞后加入等體積10%山羊血清，室溫孵育15分鐘。
9、加入熒光標(biāo)記二抗，放置冰上，避光條件下孵育30分鐘。
10、用0.5%BSA的1 X PBS洗兩遍。
11、加入500μl 1 X PBS上機(jī)檢測。
直接免疫熒光標(biāo)記法 本方法操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確，易于分析，適用于同一細(xì)胞群多參數(shù)同時測定。雖然直標(biāo)抗體試劑成本較高，但減少了間接標(biāo)記法中較強(qiáng)的非特異熒光的干擾，因此更適用于臨床標(biāo)本的檢測。
間接免疫熒光標(biāo)記法 本方法費用較低，二抗應(yīng)用廣泛，多用于科研標(biāo)本的檢測。但由于二抗一般為多克隆抗體，特異性較差，非特異性熒光背景較強(qiáng)，易影響實驗結(jié)果。所以標(biāo)本制備時應(yīng)加入陰性或陽性對照。另外，由于間標(biāo)法步驟較多，增加了細(xì)胞的丟失，不適用測定細(xì)胞數(shù)較少的標(biāo)本。
二、數(shù)據(jù)采集與分析
數(shù)據(jù)的顯示通常可分為一維單參數(shù)直方圖（histogramplot）、二維點圖（dotplot）、二維等高圖（contour）和假三維圖（pseudo3D）等。最常用的是單參數(shù)直方圖和二維點圖。
1.單參數(shù)直方圖
用來進(jìn)行定性分析和定量分析。橫坐標(biāo)表示熒光信號或散射光信號強(qiáng)度的相對值，其單位用“道數(shù)”（channel）表示，橫坐標(biāo)可以是線性的，也可以是對數(shù)的。縱坐標(biāo)通常代表細(xì)胞出現(xiàn)的頻率或相對細(xì)胞數(shù)。
單參數(shù)直方圖
2. 二維點圖
當(dāng)需要研究兩個或更多測量參數(shù)之間的關(guān)系時，可采用二維點圖。二維點圖有兩種形式，橫坐標(biāo)表示前向散射光（FSC），反映細(xì)胞的大??；縱坐標(biāo)表示側(cè)向散射光，反映細(xì)胞內(nèi)顆粒的大小和多少。坐標(biāo)圖上每一點同時表示具有相應(yīng)坐標(biāo)值的細(xì)胞存在。
二維點囤的細(xì)胞群框定 熒光單染色二維點圖
三、流式抗體選擇標(biāo)準(zhǔn)
1. 滿足抗體選擇的基本條件
靶蛋白特異性：確定目的細(xì)胞的特異性表面標(biāo)記或者胞內(nèi)標(biāo)記，知道您要檢測什么。
種屬：嚴(yán)格按照待測樣本種屬選擇抗體來源，流式抗體基本無法進(jìn)行種屬間交叉反應(yīng)。
應(yīng)用領(lǐng)域：可用于流式實驗，說明書中明確標(biāo)注經(jīng)FC實驗測試，最好有實驗數(shù)據(jù)圖和用量說明。
抗體克隆號：一般選擇參考文獻(xiàn)上提到的克??；同一抗體多個克隆號的情況下，可以選擇熒光標(biāo)記種類最多的那個克隆。
2. 確定流式細(xì)胞儀的參數(shù)配置
在設(shè)計流式方案前，先確定需要使用流式細(xì)胞儀檢測的型號，對該儀器的參數(shù)配置要了解以下幾個方面信息：
激光器：常見的流式細(xì)胞儀有488nm和635nm/633nm兩個激光器，但有些機(jī)器在購買時因某些原因，只裝了一個488nm激光器，所以需要注意型號相同的機(jī)器也未必激光配置相同。
濾光片：也就是有幾個檢測通道，這決定了你最多可以同時檢測幾個指標(biāo)。
儀器的具體型號：有助于再次確定檢測通道。因為同一個熒光在不同的流式細(xì)胞儀上檢測，有時候檢測通道也是不一樣的。
3. 熒光的選擇
選擇直標(biāo)還是間標(biāo)：待測抗原表達(dá)高的盡量選擇直標(biāo)抗體，待測抗原表達(dá)豐度低的要考慮選間標(biāo)生物素標(biāo)記標(biāo)抗體。
熒光強(qiáng)弱：熒光本身有強(qiáng)弱之分，可視抗原表達(dá)強(qiáng)弱及分群情況選擇合適的熒光。如抗原表達(dá)弱或分群不明顯的建議選擇強(qiáng)熒光例如：PE、APC；反之，抗原表達(dá)強(qiáng)或分群明顯的建議選擇最常用的弱熒光例如FITC即可（常用熒光強(qiáng)弱排序程度為：PE>APC>PE-cy5/Cy5>PerCP/PerCP-Cy5.5/Cy5.5>FITC。
4. 多色熒光搭配的原則
多色分析方案中熒光抗體的選擇和搭配，會受到很多因素的制約：
檢測通道不能沖突：每個檢測通道只能選擇1種熒光素，各通道之間的熒光素可以隨意搭配（如FL1選擇了FITC標(biāo)記的抗體，就不能再選擇Alexa Fluor488標(biāo)記的抗體；而同組實驗的其余抗體選擇PE或者APC標(biāo)記，都是可以隨意組合的）；
熒光強(qiáng)弱：所選各種熒光素光譜的重疊應(yīng)當(dāng)盡量減少，否則將會導(dǎo)致較大的補(bǔ)償。最常用的4色熒光搭配是：FITC、PE、PerCP/PerCP-Cy5.5、APC；
5. 同型對照抗體的選擇
同型對照（Isotype Control），用于消除由于抗體非特異性結(jié)合到細(xì)胞表面而產(chǎn)生的背景染色，是真正意義上的流式陰性對照，流式細(xì)胞實驗不可或缺的一項。同型對照是使用與一抗相同種屬來源、相同亞型及亞鏈、相同熒光標(biāo)記的免疫球蛋白，也要求使用相同劑量。
純化級別抗體：如果是純化的一抗加熒光標(biāo)記的二抗，那么應(yīng)該選擇與一抗相對應(yīng)的同型對照抗體（如樣品管為：純化的CD3+PE標(biāo)記的二抗+樣本；則對照管為：純化的同型對照+ PE標(biāo)記的二抗+樣本）。
四、流式檢測樣品的制備
提示
1、流式細(xì)胞儀檢測需要將細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液。
2、避免細(xì)胞成團(tuán)，以免堵塞流式細(xì)胞儀。
3、實體組織制備單細(xì)胞懸液需要物理方法分離或酶消化法進(jìn)行，具體組織的方法，依照經(jīng)驗來進(jìn)行。
方案A: 培養(yǎng)細(xì)胞的制備
實驗材料：0.25%胰，15ml或50ml的離心管。
實驗流程：
1、如果是懸浮細(xì)胞，則小心將細(xì)胞移入離心管中，進(jìn)行計數(shù)和活力分析。進(jìn)行步驟3。
2、如果是貼壁細(xì)胞，建議使用0.25%的胰酶消化細(xì)胞，制備成單細(xì)胞懸液后置于離心管中計數(shù)和活力分析。
3、200g 離心5min。棄去上清，應(yīng)用適量的流式孵育緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/ml。
方案B: 組織細(xì)胞制備。
實驗材料與試劑：剪刀和鑷子，載玻片， 60×15mm的組織培養(yǎng)皿；細(xì)胞過濾器（尼龍網(wǎng)過濾）,0.01MPBS。
實驗流程:
1、獲取組織剪碎或切碎組織為2~4mm碎塊，用1XPBS沖洗一遍，盡量多的去除組織內(nèi)血塊。
2、將剪碎的組織放在載玻片磨砂邊，滴加兩滴1XPBS, 另取一個磨砂邊的載玻片進(jìn)行研磨細(xì)胞至粘稠無顆粒物，過濾除去細(xì)胞碎片。
3、加PBS 5ml，200g離心5min，棄去上清。重復(fù)洗滌一次，計數(shù)和活力分析。
4、300g 離心5min，棄去上清，應(yīng)用適量的流式孵育緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/ml。
五、常見問題與解答
1. 高熒光強(qiáng)度背景
（1）熒光標(biāo)記的抗體濃度應(yīng)該合適，如果濃度過高，背景會因為非特異性相互作用的增加而增加。
（2）在使用第一抗體之前，將樣品與過量的蛋白一起培育，如小牛血清蛋白（BSA），脫脂干奶酪，或來自于同一寄主的正常血清作為標(biāo)記的第二抗體。這個步驟通過阻斷第一抗體和細(xì)胞表面或胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的非特異性的交互作用來降低背景。
（3）在使用第一抗體之后，將樣品與5%至10%的來自于同一寄主的正常血清和作為標(biāo)記的第二抗體一起培育。這個步驟會減少不必要的第二抗體與第一抗體、細(xì)胞表面或胞內(nèi)結(jié)構(gòu)之間的交互作用。
2. 細(xì)胞染色陽性但很弱
(1) 抗細(xì)胞因子抗體濃度不對或者熒光染料選擇不合適，增加抗體濃度，標(biāo)本表面抗原表達(dá)量低，應(yīng)該選擇熒光強(qiáng)度高的熒光染料，如PE，APC等。 (2)通透后細(xì)胞在胞內(nèi)染色前未洗, 按操作程序通透后洗細(xì)胞再胞內(nèi)染色。（3）抗體與固定后的胞內(nèi)抗原親和力低，需提高抗體濃度。
3、嚴(yán)重的細(xì)胞損失
（1）洗滌離心步驟丟失細(xì)胞，固定后細(xì)胞密度低于活細(xì)胞，需用高轉(zhuǎn)速離心，固定通透的細(xì)胞離心500g 。（2）加樣步驟丟失細(xì)胞或棄上清帶走細(xì)胞，應(yīng)小心吸樣。
六、注意事項
1. 標(biāo)本處理：（1）全血實驗 避免使用絡(luò)合鈣的抗凝劑，如ACD與EDTA，因為它們會限制鈣依賴性激活過程，推薦用肝素鈉。此外LPS，一種常見的生物試劑污染物，是強(qiáng)細(xì)胞激活劑，可能會混淆試驗結(jié)果。血樣在8小時內(nèi)分析，超過8小時會導(dǎo)致活性的損失，一般細(xì)胞因子陽性細(xì)胞會減少5%。如不能在8小時之內(nèi)檢測，應(yīng)將真空采血管水平室溫放置。（2）組織樣本制備 取組織時去除組織內(nèi)凝固的血塊。（3）固定，穿膜的試劑PH一定要正確。
2. 選擇合適的對照：為保證結(jié)合的真實和可靠性，至少熒光設(shè)置同型對照：用于消除由于抗體非特異性結(jié)合到細(xì)胞表面而產(chǎn)生的背景染色；陰性對照(Isotype Control)：非特異熒光的強(qiáng)弱取決于抗體濃度、單克隆熒光抗體特異性和純度，應(yīng)與試驗管抗體相對應(yīng)。在多色分析時，同型對照應(yīng)與其它抗體同時使用，以避免補(bǔ)償造成的誤差。
3. 熒光素的選擇：檢測相對低表達(dá)細(xì)胞因子如IL-4時，應(yīng)選用PE或APC標(biāo)記；單檢測某一細(xì)胞因子時最好也選用PE或APC標(biāo)記；同時檢測多種細(xì)胞因子時，弱表達(dá)的應(yīng)選用PE或APC，F(xiàn)ITC標(biāo)記最好用于高表達(dá)細(xì)胞因子如IFN-γ。
4.采用直接與間接免疫熒光混合染色法時，原則上先進(jìn)行間接標(biāo)記，再進(jìn)行直接標(biāo)記。間接標(biāo)記為細(xì)胞內(nèi)染色時，應(yīng)該考慮固定或透膜劑對直接標(biāo)記抗體與靶目標(biāo)的親和力或靶目標(biāo)的抗原性的變化等影響，若影響大，則應(yīng)該先標(biāo)記直接抗體。
流式檢測所需溶液和試劑
1. 1X磷酸鹽緩沖液（PBS）：將8 g氯化鈉（NaCl），0.2 g氯化鉀（KCl），1.44 g磷酸氫二鈉（Na2HPO4），0.24 g磷酸二氫鉀（KH2PO4）溶解在800 ml蒸餾水（dH2O）中。用鹽酸調(diào)節(jié)pH到7.4，定容至1升。室溫保存。
2. 4%多聚甲醛溶液（無甲醇的）： 100ml雙蒸水中加入8g多聚甲醛然后在水浴鍋中加熱至50-60℃，加入幾滴1mol/L的NaOH邊加邊攪拌直至全部溶解，溶解后置于冰水中冷卻至室溫，加入100ml的2倍的PBS。調(diào)節(jié)PH為7.4。
3. 孵育緩沖液：將0.5 g牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）溶解在100 ml的1 X PBS中。保存在4℃C。
